PLENARNO PREDAVANJE

 1.     CURRENT TRENDS IN LABORATORY DIAGNOSTICS

 Harald H. Kessler

Molecular Diagnostics Laboratory, Institute of Hygiene, KF-University, Graz, Austria

 Over the past several years, the development and application of molecular diagnostic techniques has initiated a revolution in the diagnosis and monitoring of infectious and neoplastic diseases. Molecular assays have been useful to detect infectious agents directly from clinical samples, without need for culture, to allow the determination of viral load, to demonstrate chromosomal translocations, and to detect minimal residual disease.

Molecular assays basically consist of three main steps: extraction of DNA or RNA (sample preparation), nucleic acid amplification, and detection of amplification products. To meet the needs of routine diagnostic laboratories, simplified automated technologies have recently been developed. One of the promising future techniques is real-time PCR. The LightCyclerä System, which enables the user to monitor the amplification of the PCR product simultaneously, in real-time and on-line, has recently been introduced. Because of very rapid air heating and cooling together with high surface-to-volume ratio of capillaries, a complete PCR run of 30 to 40 cycles can be performed in 20 to 30 minutes.

Real-time PCR with the LightCyclerä System has been shown to be a suitable method for the routine diagnostic laboratory. Introduction of this technology will lead to new approaches in detection and monitoring of treatment success in infectious and neoplastic disease.

 PLENARNO PREDAVANJE

2. MULTIDISCIPLINARNI DIJAGNOSTIČKU PRISTUP AKUTNIM LEUKEMIJAMA

Drago Batinić

Zavod za imunologiju, Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, Klinički bolnički centar Zagreb-Rebro, Zagreb

Dijagnoza hematoloških neoplazmi tradicionalno se temelji na citomorfološkim značajkama stanica krvotovornog tkiva i odgovarajućim citokemijskim reakcijama. Tijekom zadnja dva desetljeća svjedoci smo razvoja sofisticiranih tehnika ispitivanja krvotovornih stanica, kao i razvoja učinkovitijih strategija liječenja bolesnika s hematološkim neoplastičnim bolestima. Te dvije činjenice dovele su do korijenite promjene stava hematologa/kliničara u odnosu na dijagnostički pristup, što je nesumnjivo utjecalo na sve tješnju suradnju hematologa i laboratorija, odnosno različitih laboratorijskih struka tijekom dijagnostičkog postupka. Nove laboratorijske metode, kao što su imunofenotipizacija monoklonskim protutijelima, klasična (pruganje kromosoma) i interfazna citogenetika (FISH), te molekularno-genetske analize preuredba gena za antigenski receptor limfocita i fuzijskih gena nastalih translokacijom, danas više nisu metode znanstvenog istraživanja, već su postale dio rutinskog dijagnostičkog postupka o kojima ovisi liječenje bolesnika. To se najbolje očituje na primjeru nove podjele hematoloških zloćudnih bolesti prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji (W.H.O.). Nova je shema usvojila REAL-ovu klasifikaciju limfoidnih neoplazmi u kojoj je svaki entitet definiran skupnim nalazom citomorfologije, imunofenotipizacije, genetskih obilježja stanica (citogenetika i molekularno-genetski nalaz), kao i kliničkim obilježjima. U novoj WHO-klasifikaciji slično je načelo primjenjeno i na mijeloidne i histiocitne neoplazme. Osnovni cilj nove klasifikacije jest definicija stvarnih ("real") entiteta koji imaju značaj za kliničko vođenje bolesnika, tj. za prognozu i odabir adekvatnog liječenja bolesnika.

Razvoju visokospecijaliziranih tehnika analize hematopoetskih stanica doprinjeo je svakako i koncept praćenje bolesnika tijekom pojedinih faza liječenja - određivanje minimalne ostatne ili rezidualne bolesti (MOB). U tom je pogledu razvoj novih tehnologija za kvantifikaciju produkata reakcije PCR ili razvoj multiparametrisjke protočne citometrije vrlo indikativan.

Pored ove temeljne zadaće, držim da postoje barem još tri dodatna razloga koji govore u prilog potrebe za ekstenzivnim istraživanjem hematoloških neoplazmi: a) širenje znanstvenih spoznaja o biološkim osobinama hematoloških neoplazmi; b) trajna edukacija kliničara/hematologa i eksperta pojedinih laboratorijskih struka; i c) održavanje interesa za laboratorijsku medicinu. Navedni ciljevi bili su i glavni pokretači projekta multidisciplinarne analize leukemijskih stanica u našoj ustanovi, s posebnim naglaskom na analizu bioloških parametara stanica bifenotipskih ili miješanih akutnih leukemija. Stoga ću u prvom dijelu izlaganja izložit načela multidisciplinarnog pristupa u dijagnostici akutnih leukemija, dok ću u drugom dijelu izložiti koncept analize miješanih akutnih leukemija u okviru našeg projekta.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

3.     EKSPRESIJA OSTEONEKTINA (SPARC) U KRVOTVORNIM STANICAMA

Rajko Kušec^1,2, Ika Kardum-Skelin², Mara Dominis², Helen Turley³

¹Zavod za molekularnu medicinu Inst. “Ruđer Bošković” ²Klinička bolnica “Merkur” Zagreb; Odjeli kliničke citologije te Patologije s citologijom,³LRF immunodiagnostic Unit, University of Oxford

SPARC/Osteonektin je glikoprotein značajan za vezu stanice i vanstanične potke (matriksa). Poznata je njegova uloga u diferencijaciji, embriogenezi te reparaciji tkiva, a sve je više spoznaja o njegovoj ulozi u biologiji tumora, osobito metastaziranju. Opisali smo proteinsku (imunocito- i histokemijski) ekspresiju ON/SPARC-a na stanicama normalne i maligno promijenjene hematopoeze. SPARC, testiran protutijelom SSP2 (autor Helene Sage, Seattle)  je prisutan intracitoplazmatski u diferenciranim stanicama mijelo- i limfopoeze dok nije zabilježen u eritroidnoj lozi. Iako je nekoliko ranijih studija opisalo ekspresiju ON/SPARCa u megakariocitima (western blotom) i aktiviranim trombocitima, naše protutijelo, usmjereno na domenu za vezanje kalcija u molekuli, nije potvrdilo taj nalaz. Tumorski blasti akutne mijeloične leukemije nisu pokazivali reaktivnost, međutim, u akutnoj promijelocitnoj leukemiji dio je populacije nezrelih stanica bio pozitivan. Normalne i plazma stanice multiplog mijeloma su jako eksprimirale ON/SPARC radi čega započinjemo istraživanje moguće upotrebe ovog proteina kao biljega za ocjenu veličine tumorske mase multiplog mijeloma odnosno njegove vrijednosti u praćenju minimalne ostatne bolesti.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

4.   LAKTOFERIN U BOLESNIKA S MIJELOPROLIFERATIVNIM BOLESTIMA I MIJELODISPLAZIJOM

Sučić M¹, Boban D¹, Marković-Glamočak M¹, Batinić D¹, Užarević B¹, Zadro R¹, Mrsić S¹, Ries S¹, Gjadrov-Kuveždić K¹, Labar B², Nemet D², Mrsić M², Stavljenić-Rukavina A¹

Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku¹ i  Zavod za hematologiju²

Klinički bolnički centar Zagreb

Laktoferin, protein koji se nalazi u sekundarnim zrncima zrelijih stanica granulocitopoeze ima bakteriostatsko djelovanje. Noviji izvještaji ukazuju da uloga laktoferina još nije u potpunosti poznata.

U bolesnika s akutnom mijeloičnom leukemijom (AML) ili mijelodisplazijom (MDS) uz nezrele maligne stanice, često barem dio preostalih zrelih stanica granulocitopoeze pokazuje neka odstupanja (citomorfološke, biokemijske, imunofenotipske, citogenetske i molekularne promjene), pa tako i manje laktoferina.

Cilj rada je bio usporediti postotak laktoferin pozitivnih zrelih stanica granulocitopoeze u koštanoj srži u bolesnika s kroničnom mijeloproliferativnom bolešću, u bolesnika s MDS-om i u bolesnika s AML-om u remisiji bolesti  s istim vrijednostima kontrolne skupine.

U skupini bolesnika bilo je 11 bolesnika s AML-om, 9 bolesnika s kroničnom mijeloproliferativnom bolešću i 6 bolesnika s MDS-om. Kontrolnu skupinu čine 18 ne-hematoloških bolesnika. Dijagnoza bolesti postavljena je nakon citomorfološke i citokemijske analize koštane srži i periferne krvi prema FAB i WHO klasifikaciji. Laktoferin je u stanicama granulocitopoeze određen APAAP imunocitokemijskom metodom. Rezultati usporedbe su pokazali da sve skupine bolesnika imaju statistički značajno manji postotak laktoferin pozitivnih zrelih stanica granulocitopoeze u odnosu na kontrolnu skupinu (p< 0.001). U većine bolesnika sve tri skupine utvrđene su i karakteristične citogenetske i molekularne promjene. Rezultati rada ukazuju da zrele stanice granulocitopoeze u bolesnika s MDS-om i bolesnika s kroničnom mijeloproliferativnom bolešću pokazuju odstupanja od zrelih stanica granulocitopoeze normalne hematopoeze, te da je diferencijacija stanica granulocitopeze u bolesnika s AML-om izmijenjena i u remisiji bolesti.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

5.     MORFOLOŠKE KARAKTERISTIKE AKUTNIH LEUKEMIJA S KROMOSOMSKIM ABNORMALNOSTIMA

Šušterčić D¹, Kardum-Skelin I¹, Borovečki A¹, Anić V¹, Minigo H¹, Vrhovac R¹, Hitrec V², Lasan R², Kušec R³, Jakšić B¹

Klinika za unutarnje bolesti KB «Merkur»¹, Zavod za citogenetiku Klinike za dječje bolesti KBC Rebro², Institut «Ruđer Bošković»³ , Zagreb

Neke specifične kromosomske abnormalnosti u akutnim leukemijama udružene su s karakterističnom morfologijom i imaju različitu kliničku sliku (WHO 2000). Specifične kategorije definiraju se kao: AML t(8;21)(q22;q22), 2. akutna promijelocitna leukemija s t(15;17)(q22;q11-12) i varijante, 3. AML s abnormalnim eozinofilima u koštanoj srži inv (16)(p13:q22) ili t (16;16)(p13;q22), 4. AML s 11q23 (MLL) abnormalnosti, 4. Burkitt cell leukemija i translokacija 8;14 itd.

U KB «Merkur» je liječeno 317 akutnih leukemija citogenetski tipiziranih u Zavodu za citogenetiku Klinike za dječje bolesti KBC Rebro. U svega 10 slučajeva (3.1%) analiza nije bila moguća ili je bila manjkava. 47% akutnih leukemija je bilo bez kromosomskih abnormalnosti. U 53% svih leukemija (podjednako AML i ALL) nađene su citogenetske abnormalnosti.

Potvrđena je dobra korelacija između morfološke slike i pripadajuće abnormalnosti kod akutne promijelocitne leukemije i translokacije 15;17, te Burkitt cell leukemije i translokacije 8;14, kao i u akutnoj mijeloičnoj leukemiji s tanslokacijom 8;21 ako se dovoljno na to misli, nešto manja kod AML s abnormalnim eozinofilima u koštanoj srži  i inverziji 16, dok je akutnu leukemiju s kromosomskom promjenom 11q23 nemoguće morfološki prepoznati.

Morfologija i imunofenotipizacija nisu same dovoljne za klasifikaciju akutnih leukemija te je citogenentska analiza obavezna u subtipiziranju specifičnih kategorija.            

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

6.     PCR IN SITU U DIJAGNOSTICI AKUTNE MIJELOIČNE LEUKEMIJE SA SAZRIJEVANJEM

Gjadrov-Kuveždić K, Sučić M, Boban D, Marković-Glamočak M, Ries S,

Zadro R, Batinić D, Mrsić S, Stavljenić- Rukavina A, Labar B

Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, Zavod za citologiju, KBC Zagreb

Klasifikacija Svjetske zdravstvene organizacije o mijeloidnim i limfoidnim neoplazmama uključuje akutne mijeloične leukemije koje nose t(8;21), t(15;17), inv(16) i preuredbe gena MLL na kromosomu 11 u zasebne podskupine.

Velika je klinička važnost prepoznati bolesnike, koji imaju kriterije za svrstavanje u te podskupine akutnih mijeloičnih leukemija, jer oni u pravilu pokazuju bolji odgovor na terapiju, brži ulazak u remisiju bolesti, a time i dulje preživljenje. Citomorfološki i citokemijski nalaz osnova je dijagnoze akutnih leukemija, no PCR-om in situ moguće je dijagnosticirati i leukemije koje osim prepoznatljivog morfološkog fenotipa sadrže i promjene genoma. U našem istraživanju analizirali smo 21 bolesnika s citomorfološki i citokemijski dijagnosticiranom akutnom mijeloičnom leukemijom sa znacima sazrijevanja (M2 prema FAB-u), i primjenom PCR-a in situ dijagnosticirali 5 leukemija pozitivnih na t(8;21). Translokacija uvjetuje stvaranje fuzijskog gena AML1/ETO. PCR-om in situ također smo pratili bolesnike pozitivne na AML1/ETO i tijekom remisije bolesti, što nam je omogućilo razlikovanje malignih nezrelih stanica od nezrelih stanica normalne hematopoeze, koje nastaju tijekom oporavka koštane srži. Primjena PCR-a in situ, kao morfološke molekularne metode, povećava osjetljivost citomorfološke analize.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

7.     AKUTNA LEUKEMIJA SA ZRNCIMA – PRIKAZ SLUČAJA

Ries S, Boban D, Marković-Glamočak M, Sučić M, Gjadrov-Kuveždić K, Batinić D, Mrsić S, Zadro R, Labar B.

Zavod za kliničko-laboratorijsku dijagnostiku, Zavod za hematologiju, KBC Zagreb

Bolesnik je upućen  u Zavod za hematologiju s dijagnozom akutne mijeloične leukemije. Pri primitku je punktirana koštana srž i uzeti su uzorci za citomorfologiju, imunotipizaciju, citogenetiku, molekularnu analizu i ultrastrukturnu analizu.

Citomorfološki su nađeni blasti  sa sitnim, brojnim, crvenkastim granulama. Učinjena su citokemijska bojenja. Blasti su bili MPO, sudan i ANAE negativni, a PAS pozitivni. Metakromatsko bojenje toluidinom se prikazalo nespecifično. Imunocitokemijski su limfatični biljezi bili pozitivni u većini blasta .

Nalaz  imunotipizacije prikazuje neoplazu prekursora B-stanica imunofenotipa "common -ALL" uz koekspresiju mijeloidnih biljega. Nalaz citogenetike isključuje t(15;17).

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

8.   PRIJELAZ SISTEMSKE MASTOCITOZE U MASTOCITNU LEUKEMIJU - PRIKAZ SLUČAJA

Boljkovac S,¹ Kardum Skelin I,² Šušterčić D,² Borovečki A,² Dominis M,³ Minigo H,² Vrhovac R,² Jakšić B²

Privatna citološka ordinacija  Karlovac,¹ Klinika za unutarnje bolesti² i Klinička patologija i citologija KB “Merkur”³ Zagreb

Bolesnica, (39) godina hospitalizirana je u više navrata u MC Karlovac te Klinici za unutarnje bolesti KB" Merkur" zbog sumnje na mastocitozu. Klinički bolesnica je patila od napadaja koji se javljaju više puta tjedno, a počinju kao osjećaj gušenja, nakon čega slijedi lupanje srca, crvenilo lica praćeno gubitkom svijesti. Nakon napada obično uslijedi temperatura, ginekološko krvarenje i nekontrolirana stolica. Bolesnica ja smršavila 10 kilograma u 6 mjeseci i javio se svrbež kože, osobito dlanova i tabana. Status je uredan. Od nalaza prisutna je ubrzana sedimentacija, leukocitoza ( 21×10⁹/L ), anemija. U leukogramu se nađe 14% eozinofilnih  granulocita, a punkcijom koštane srži 36% eozinofilnih  granulocita i  24% toluidin pozitivnih stanica - mastocita. Uz ordiniranu terapiju kortikosteroidima, antihistaminicima, nakon 8 mjeseci dolazi do pogoršanja bolesti uz svakodnevnu pojavu napada i leukocitozu ( 64 - 107× 10⁹/L ). Pogoršanje se verificira u punktatu i bioptičkom uzorku kosti - porast broja atipičnih mastocita 44%, uz pojavu mastocita i u perifernoj krvi.  Kariogram iz stanica koštane srži nije pokazao klonalne abnormalnosti. U terapiju se uvode i citostatici, a bolesnica nakon 3 mjeseca umire pod slikom hemoragijske dijateze i sepse.

Sistemska mastocitoza često je udružena  s eozinofilijom, dok pojava limfadenopatije, izostanak infiltracije kože i udruženost s mijeloproliferativnim i mijelodisplastičnim bolestima upučuje na lošu prognozu. Sistemska mastocitoza može preći u akutnu leukemiju obično u M1, M2 ili M4 rijeđe u M6 i M7, a najrjeđe u mastocitnu leukemiju. Mastocitna leukemija najčešće nastaje de novo, a rijeđe iz urtikarije pigmentoze odnosno sistemske mastocitoze.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

9.  AIDS-RELATED BODY-CAVITY-BASED LYMPHOMA: CASE PRESENTATION

A.Vince¹, J. Begovac¹, H. Kessler², Z. Šiftar¹, S. Židovec¹, M. Poljak³, T. Jeren¹

University Hospital for Infectious Diseases, Zagreb¹,Institute of Hygiene, Karl-Franzens University, Graz²,

Mikrobiološki Institut, Medicinski Fakultet, Ljubljana ³

Background: Body-cavity-based lymphomas are rare malignancies in HIV infected patients but because of their unusual clinical, morphologic and immunophenotypic features they are recognized as a distinct subgroup of lymphomas connected to human herpesvirus 8 (HHV-8) infection.

Case presentation: A 39-years old HIV-positive homosexual man was admitted to the hospital because of left sided pleural effusion which contained malignant lymphoid cells. He responded partially to a low dose CHOP regimen and died 5 months after the diagnosis of lymphoma.

Cytology: The sediments of pleural effusion contained exclusively large round neoplastic lymphoid cells with abundant basophilic cytoplasm, large round nuclei with prominent nucleoli. Many cells had immunoblastic features and some plasmocytoid differentiation, mitotic figures were numerous.

Flow-cytometry: The homogenous population of large cells expressed CD45, CD38,

HLA-DR and unexpectedly CD7 positivity. Other specific T, B , NK cells markers tested negative.

PCR proved EBV and HHV-8 presence in malignant effusion.

Conclusion: Primary effusion lymphoma with molecular evidence of HHV-8 and EBV coinfection represents a distinct clinical and morphological entity in AIDS patients. However immunophenotypic markers of malignant clone can be diverse in different cases.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

10.       CITODIJAGNOSTIKA LIMFADENOPATIJA VRATA

Branka Lončar, Blaženka Staklenac, Biljana Pauzar, Irena Hihlik-Babić, Marija Pajtler

Klinička bolnica Osijek

Prikazani su rezultati aspiracijske citodijagnostike limfadenopatije vrata  271 bolesnika. U 188 aspirata je postavljena citološka dijagnoza bila benigna,  u 53 aspirata maligna  a 30 aspirata je bilo nezadovoljavajuće za davanje citološkog mišljenja. Usporedbom citološkog  i patohistološkog nalaza (41 bolesnik) nađena je podudarnost u 90,2% slučajeva, u 2,4% slučaja nalaz je bio lažno pozitivan, a u 4,9%  nalaz je bio lažno negativan. Osjetljivost metode je 93,3% a specifičnost 90,9%.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

11.     IMUNOCITOKEMIJA U DIJAGNOSTICI I SUBTIPIZACIJI BOLESTI LIMFNOG ČVORA

Kardum-Skelin I,¹ Šušterčić D,¹ Borovečki A,¹ Križaj B,¹ Kardum MM,² Šiftar Z,² Planinc-Peraica A,¹ Minigo H,¹ Ostojić A,¹ Vrhovac R,¹ Radić-Krišto D,¹ Marić-Bešić K,¹ Džebro S,³ Jakšić B¹

Klinika za unutarnje bolesti,¹ Zavod za kliničku kemiju² i Klinička patologija i citologija KB “Merkur”,³ Zagreb

Imunofenotipizacija u dijagnostici  bolesti limfnog čvora zauzima značajno mjesto. S jedne strane je od velike pomoći pri razlikovanju reaktivnih hiperplazija od B NHL-a, a s druge strane u subtipizaciji limfoma, koja se temelji na određivanju diferencijacijskih biljega limfatičnih stanica.

Cilj rada je bio: 1. analizirati adekvatnost uzoraka punktata limfnih čvorova na protočnom citometru; 2. analizirati prisustvo klonalnosti u svrhu odvajanja reaktivnih od B klonalnih poremećaja; 3. analizirati podudarnost citološke i histološke subtipizacije s imunofenotipom učinjenim na protočnom citometru; 4. analizirati mogućnost subtipizacije ALCL-a od HB te velikostaničnih limfoma od slabo diferenciranih tumora drugog staničnog podrijetla imunocitokemijskom analizom na razmazima upotrebom kombinacije staničnih biljega.

U KB "Merkur" u razdoblju od 3 godine učinjena je 201 analiza punktata limfnih čvorova na protočnom citometru. Određivana je prvenstveno klonalnost, a u slučajevima monoklonalnih neoplazmi i subtipizacija. Adekvatnost uzorka za analizu iznosila je 95.1%. Poliklonalnost u citološki dijagnosticiranih reaktivnih hiperplazija iznosila je 98.9% (91/93) što daje veliku sigurnost u odvajanju  malignih limfoma B fenotipa od reaktivnih hiperplazija. Podudarnost imunofenotipa (odvajanje T i B neoplazmi) u odnosu na citološku dijagnozu iznosila je 97.1% (102/105), te 94.2 (65/69) za patohistološku dijagnozu. Sukladnost subtipizacije limfoma imunološki, citološki i patohistološki pokazala je znatno nižu reproducibilnost od svega 50.7% (35/69). Imunofenotipizacija protočnim citometrom nije nam pomogla u dijagnostici perifernih T limfoma i Hodgkinove bolesti.

U slučajevima kad je limfni čvor nedostupan eksciziji i patohistološkoj analizi, kod infiltracije tjelesnih tekućina limfomskim stanicama, tijekom praćenja bolesti, razlikovanju ALCL-a od HB te  velikostaničnih limfoma od slabo diferenciranih tumora drugog biološkog podrijetla pomaže nam imunocitokemijska analiza na citološkim razmazima upotrebom kombinacije staničnih biljega.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

12.     USPOREDBA REZULTATA CITOMORFOLOŠKE I IMUNOFENOTIPIZACIJSKE

ANALIZE STANICA U PUNKTATIMA KOŠTANE SRŽI KOD B-NON HODGKIN

LIMFOMA (B-NHL)

Šiftar Z,¹ Kardum MM,¹ Nazor A^1, Kardum-Skelin I², Šušterčić D²

Zavod za kliničku kemiju,¹ Zagreb i Klinika za unutarnje bolesti² KB"Merkur", Zagreb

B-Non Hodgkin Limfom (B-NHL) je heterogena skupina bolesti imunog sistema koji se morfološki i klinički različito predstavljaju. Najčešće su zahvaćeni limfni čvorovi, slezena, koštana srž, ali također zbog nepostojanosti imunološkog odgovora mogu biti okupirani i ostali organi.

Korisnost citomorfološke analize i imunofenotipizacije metodom protočne citometrije na punktatima koštane srži je ispitana u slučajevima sumnje na infiltraciju koštane srži malignim stanicama. U periodu od 7. mjeseca 1977. do kraja 2. mjeseca 2000. na 41 punktatu koštane srži istovremeno su učinjene obje analize poradi otkrivanja infiltracije koštane srži stanicama B-NHL-a koji je dijagnosticiran istovremeno ili neposredno prije u citološkim punktatima limfnog čvora.

Od ukupnog broja punktata koštane srži, u 35 (88%) je metodom protočne citometrije dokazana zahvaćenost koštane srži malignim klonom, a istovremeno citomorfološkim pregledom je isto dokazano u 30 slučajeva (73%). Suglasnost mišljenja između obje metode je postignuta u 35 slučajeva  (85%) od kojih je pozitivnim proglašeno 30 uzoraka, a negativnim 5. Neslaganje je bilo u 6 slučajeva; 5 njih je bilo pozitivno metodom protočne citometrije, uz negativan citomorfološki nalaz, a u jednom pozitivan je bio citomorfološki, a negativan nalaz imunofenotipizacije. Prema REAL klasifikaciji limfoma, od 30 punktata koštane srži u kojima su dokazane maligne stanice B-NHL-a objema metodama, njih 19 (63%) je istovjetno okarakteriziran, dok u 11 slučajeva je postojalo neslaganje u mišljenju, što upućuje moguće na nedostatnost korištene REAL klasifikacije, odnosno ograničenosti primjenjenih metoda.

Osnovna primjena obiju metoda u otkrivanju infiltracije koštane srži malignim stanicama B-NHL-a se pokazala vrlo učinkovita, uz vrlo dobro slaganje rezultata, pri čemu se metode međusobno nadopunjuju.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

13.        KROMOSOMSKE ABNORMALNOSTI LIMFNIH ČVOROVA IZ CITOLOŠKOG PUNKTATA

Šušterčić D¹, Kardum-Skelin I¹, Borovečki A¹, Hitrec V², Lasan R², Kušec R³, Planic-Peraica A¹, Ostojić¹ S, Radić-Krišto¹ D, Jakšić B¹

Klinika za unutarnje bolesti KB «Merkur»¹, Zavod za citogenetiku Klinike za dječje bolesti KBC «Rebro»², Instiut «Ruđer Bošković»³, Zagreb

Podjela limfoidnih neoplazmi prema klasifikaciji Svjetske Zdravstvene Orgnizacije (WHO) temelji se na morfološkim, imunofenotipskim, genetskim i kliničkim pokazateljima.

Cilj rada bio je 1. analizirati adekvatnost kuture  limfatičnih stanica dobivenih citološkom punkcijom limfnog čvora tankom iglom; 2. usporediti   kromosomske aberacije s citološkom dijagnozom neoplastičnih poremećaja u limfnom čvoru.

Rezultati su pokazali da je u 22/25 uzorka (88%) bilo dovoljno materijala za kromosomsku analizu. Uredan kariotip nađen je u 24% uzoraka: kod reaktivnih hiperplazija (3/3); Non Hodgkin limfoma T periferni tip (2/2) i limfoblastičnog NHL-a (1/4). Kromosomske abnormalnosti nađene su u 64% ispitivanih limfnih čvorova: hiperdiploidije u limfoblastičnom limfomu i imunocitomu. Specifične kromosomske translokacije slagale su se s citološkom dijagnozom  u 82% slučajeva. Isto tako nađene su istovremeno u istom uzorku kompleksne abnormalnosti karkateristične za različite subtipove NHL-a.

Kultura stanica iz punktata limfnog čvora je adekvatna metoda za kromosomsku analizu koja daje dodatne informacije u preciznijoj dijagnozi  poremećaja limfnog čvora naročito u pojedinim subtipovima NHL-a te izdvajanju kompleksnih abnormalnosti kao loših prognostičkih subgrupa.

SIMPOZIJ HEMATOLOŠKA CITOLOGIJA

14.  T- gama – LIMFOPROLIFERATIVNA BOLEST (T-gama LPB)-

PRIKAZ SLUČAJA

Kardum MM,¹ Šiftar Z,¹ Planinc-Peraica A,² Kardum-Skelin I,² Šušterčić D,² Borovečki A,²   Nazor A,¹ Jakšić B²

Zavod za kliničku kemiju¹ i Klinika za unutarnje bolesti¹ KB “Merkur”, Zagreb

Pacijent star 31 godinu javlja se u ambulantu Klinike za unutarnje bolesti KB "Merkur" u siječnju 1998. godine poradi povišenih temperatura, učestalih infekcija i grlobolja unatrag godine dana (1986. prebolio toksoplazmozu). Laboratorijski nalazi pokazali su normalan broj leukocita (L=6.9; Hb 147; Tr 203), no DKS ukazuje na apsolutnu limfocitozu i neutropeniju (Ly=75%; Seg=9%), te se sa sumnjom na limfoproliferativnu bolest pacijent upućuje na Infektivnu kliniku poradi infektivne obrade (dokumentacija nepotpuna). U lipnju iste godine ambulantno se obradi u Hematološkoj ambulanti Klinike za unutarnje bolesti, gdje se citološkom obradom nalazi infiltracija periferne krvi (Ly=76%) i koštane srži (Ly=29%) umnoženim limfocitima sa azurofilnim zrncima u citoplazmi (T-gama- LPS). Imunofenotipizacijom stanica periferne krvi i koštane srži nalaze se T-limfociti fenotipa:CD2+CD3+CD7+CD8+CD4-CD57+CD38+CD56- sa aberantnošću biljega CD5 (pozitivan na približno 65% zrelih T-limfocita) i dominacijom citotoksično-supresijskih T-limfocita (CD3+CD57+) uz CD3+CD8+>>CD3+CD4+) (fenotip T-gama limfocita). Zbroj subpopulacija zrelih T-limfocita (~77%) daleko je manji od iskazane pozitivnosti biljega ovih stanica (CD3=90.4%). U plazmi pacijenta antigranulocitna ni leukoaglutinirajuća antitijela nisu dokazana, a UZV abdomena opisuje jetru i slezenu uredne strukture. Limfadenopatija se ne nalazi. Kariogram koštane srži uredan je (46xy) i bez klonskih poremećaja. Histološki nalaz opisujući normocelularnu koštanu srž sa intersticijalno lagano umnoženim limfatičkim stanicama zrelih oblika ne potvrđuje pozitivan citološki i imunofenotipizacijski nalaz T- gama-LPS. Iako je većina T-gama-LPB citomorfološki homogena, a iskazani imunofenotip T-limfocita ukazuje na fenotip T-gama-limfocita, sniženi zbroj subpopulacija zrelih T-limfocita u odnosu na njihov ukupan broj mogao bi pretpostaviti postojanje "atipičnih"  T -gama-limfocita unutar T-gama-LPB.

POSTER

15.     TEST PROLIFERACIJE LIMFOCITA S POMOĆU PROTOČNE CITOMETRIJE

M. Rudolf, B. Užarević, D. Batinić

Zavod za imunologiju, Klinički zavod za laboratorijsku dijaganostiku, KBC Zagreb

Sposobnost proliferacije limfocita pod utjecajem nespecifičnih mitogena ili antigena u kulturama in vitro određivana je različitim metodama. Jedna od metoda koja se počela koristiti u novije vrijeme je analiza staničnog ciklusa s pomoću propidijevog jodida na protočnom citometru. Propidijev jodid je boja koja se stehiometrijski veže za dvostruku uzvojnicu DNK i na taj način je pogodan za praćenje sadržaja DNK u staničnom ciklusu. Analizom DNK na protočnom citometru moguće je odrediti pojedine faze staničnog ciklusa kao što su G₀/G₁, S i G₂/M. Praćenjem sinteze DNK (S-faza) određujemo staničnu proliferaciju tj. količinu de novo nastale DNK, nakon stimulacije limfocita mitogenima ili antigenima. Test proliferacije limfocita temelji se na metodi Hartzmana i sur. Stanice se izoliraju iz periferne krvi na gradijentu fikol-triozila. Nakon ispiranja u mediju 199 limfociti se podese na koncentraciju 6-8 x 10⁶/mL. U sterilne pločice za mikrokulturu dodaje se inaktivirani AB serum, pročišćeni limfociti, medij 199, te optimalno razrijeđeni mitogeni ili antigeni. Paralelno se rade po tri uzorka sa svakim mitogenom ili antigenom i tri kontrole bez mitogena ili antigena. Kulture se inkubiraju 64-72 sata na 37⁰ C uz konstantne uvjete protoka CO₂, zraka i vlažnosti. Nakon inkubacije stanice se pokupe, oboje Vindelovom bojom koja sadrži propidijev jodid i na taj način priređuju za mjerenje na protočnom citometru u programu Cellquest. Rezultati se analiziraju u programu ModFit i izražavaju u relativnim postocima.

Test proliferacije limfocita ima široku primjenu u bazičnim i kliničkim istraživanjima. Koristi se u istraživanju kongenitalnih imunoloških defekata, u praćenju imunosupresivne terapije, za određivanje različitih citokina, otkrivanje serumskih čimbenika koji mogu spriječiti ili potaknuti imunološku reakciju, za praćenje imunološkog statusa bolesnika u različitim kliničkim stanjima kao što su operacija, anestezija, transplantacija, maligne bolesti itd.    

POSTER

16.     OSOBITOSTI KOŠTANOG TKIVA U MIJELODISPLASTIČNOM SINDROMU

Vesna Kušec, Mara Dominis, Rajko Kušec, Mladen Petrovečki

Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku KBC Zagreb, Zavod za patologiju KB Merkur, Institut Rudjer Bošković, Zavod za biokemiju KB Dubrava, Zagreb

Promjene sadržaja koštane srži u mijelodisplastičnom sindromu (MDS) utječu na zbivanja koštanog tkiva. Cilj ovog rada je procjena osobitosti koštanog tkiva i njihova povezanost s preživljenjem. Istraživanje je obuhvatilo 51 bolesnika s MDS-om (33 M, 18 Ž, dob 20-83 godina, praćenje 1-55 mjeseci) u kojih je učinjena evaluacija koštane srži i histomorfometrijska analiza biopsije kosti. Obujam kosti, površina s osteoidom i debljina gredica bile su u prosjeku snižene, a površina s razgradnjom kosti i broj gredica povišeni u odnosu na kontrolnu skupinu. Nije uočen utjecaj dobi, spola ili dijagnostičke podskupine s rezultatima histomorfometrijske analize ili drugim pokazateljima u ovom istraživanju. U bolesnika u kojih nije uočeno netipično povećanje blasta za dijagnostičku podskupinu MDS-a preživljenje je bilo dulje. U tih bolesnika je  preživljenje također bilo povezano s povišenom resorpcijom kosti tj. resorpcija veća od 8% je bila preduvjet za preživljenje tijekom razdoblja praćenja bolesnika. Ovi rezultati ukazuju na postojanje promjena koštanog tkiva u MDS bolesnika pri postavljanju dijagnoze. Dulje preživljenje je bilo u bolesnika bez netipično visokog udjela blasta u srži i s povećanom resorpcijom kosti, što ukazuje na postojanje pogodnih uvjeta u koštanoj srži za diferencijaciju i aktivnost osteoklasta, stanica podrijetlom iz monocitno-makrofagne linije.

POSTER

17.     PRIKAZ BOLESNICE S AKUTNOM LEUKEMIJOM I MALIGNIM SCHWANNOMOM

Ries S, Hutinec Z, Boban D, Marković-Glamočak M, Sučić M, Gjadrov-Kuveždić K, Podolski P, Kovačević-Metelko J

Zavod za kliničko-laboratorijsku dijagnostiku, Zavod za hematologiju, KBC Zagreb

Bolesnica dolazi 1995. godine zbog limfadenopatije i hipersplenizma. Učinjena je punkcija limfnog čvora u kojoj se nalaze elementi granulomatozne upale. Punkcijom koštane srži nalazi se oskudnije hematopoetsko tkivo, morfološki u granici normale.

Patohistološki: tuberkulozni limfadenitis

Liječi se antituberkuloticima. Slezena je i dalje uvećana.

Početkom 1998. javlja se pancitopenija. U koštanoj srži nalazi se 14% blasta i 10% blasta u razmazu periferne krvi. Zbog sumnje na MDS učini se biopsija kosti. Javlja se opsežan hematom koji je kirurški obrađen i uzet je uzorak za PHV.

Patohistološki nalaz odgovara malignom Schwannomu koji infiltrira sjednu kost i širi se u koštanu srž.

Bolesnica prima odgovarajuću kemoterapiju.

Kontrolnom punkcijom koštane srži dijagnosticirana je AML (70% blasta), koja nakon terapije ulazi u remisiju.

POSTER

18.      NON-HODGKIN LIMFOM NADBUBREŽNIH ŽLIJEZDA S INFILTRACIJOM MOZGA

Borovečki A¹, Kardum-Skelin I¹, Šušterčić D¹, Sabljar-Matovinović M¹, Prkačin I¹, Ostojić S¹, Planinc-Pearica A¹, Drinković I², Škegro D¹, Gašparov S³, Žarković K⁴

Klinika za unutarnje bolesti,¹ Zavod za radiologiju² i  Klinička patologija i citologija KB «Merkur»³, Zavod za neuropatologiju KBC Rebro⁴, Zagreb

Bolesnik, star 67 godina primljen je na Kliniku za unutarnje bolesti KB «Merkur» u listopadu 1999. godine. Tri mjeseca ranije počeo se žaliti na slabost i umor uz gubitak tjelesne težine od 15 kg te osjećaj nesigurnosti u hodu i govoru.Ultrazvučnim i CT pregledom utvrđeno je obostrano povećanje nadbubrežnih žlijezda (desno 48x60 mm, a lijevo 36x36 mm). CT mozga govorio je za atrofične promjene frontalno. Laboratorijski nalazi nisu upućivali na primarni proces nadbubrežnih žlijezda, pulmološkom obradom isključen je primarni proces na plućima, a gastroskopski nalaz je bio uredan. Pri prijemu na našu Kliniku bolesnik je bio teže kontaktibilan, afebrilan, a heteroanamnestički se doznaje da se pojačano znoji i da su primjećene koreotične kretnje.  Citološkom punkcijom pod kontrolom ultrazvuka na osnovu morfologije stanica i staničnih biljega na citološkim preparatima postavi se dijagnoza B velikostaničnog Non-Hodgkin limfoma - DLBCL (stanice su pozitivne na CD 45 i CD 20, a negativne na  CD 30 i Cd 3). Na ordiniranu terapiju stanje pacijenta se privremeno poboljšava, ali je i dalje vrlo teško, te je dva mjeseca od prijema nastupila smrt. Obdukcijski nalaz potvrdio je infiltraciju obje suprarenalne žlijezde te kliničku sumnju na infiltraciju mozga stanicama velikostaničnog B limfoma.

Lokalizacija NHL-a u nadbubrežnim žlijezdama i mozga je izuzetno rijetka. Citološka analiza upotpunjena staničnim biljezima može suvereno odvojiti takav tip tumora od ostalih tumora nadbubrežne žlijezda.