PLENARNO PREDAVANJE

55.      KOMPJUTERSKA ANALIZA SLIKE - IMAGE ANALYSIS

Kardum-Skelin I

Klinika za unutarnje bolesti KB "Merkur" Zagreb

Komjuterska analiza slike, u današnje vrijeme, nije samo dobro utemeljena i visoko razvijena metodologija, već postaje široko upotrebljavana i sve više primjenjivana na različitim poljima dijagnostike u kliničkim laboratorijima.

Uvođenjem računala u analizu slike omogućena je njena: obrada,  analiza, usporedba, selekcija određenih segmenata slike te pohranjivanje slika s mogućnošću kreiranja baze podataka.

Automatski analizator slike se sastoji od mikroskopa, video kamere i računala s odgovarajućim programom za analizu slike, koja omogućava  numeričku objektivizaciju najsuptilnijih promjena nedostupnih vizualnoj inspekciji te umjesto subjektivne procjene dolazi do objektivne kvantifikacije određenih parametara.

Mnogi  parametri i osobitosti stanica su prihvatljivi za digitalnu analizu: 1. morfometrijske karakteristike; 2. određivanje količine DNA - statička DNA citometrija; 3.kvantifikacija imunocitokemijskog bojenja; 4. određivanje proliferacijskog statusa (Ki-67, Ag NOR);5. kariometrija itd.

Kvantitativna mjerenja,   bez obzira da li su mikrofotometrijske, mikromorfometrijske ili stereološke prirode zahtjevaju standardizaciju uzorka: pripremu, fiksaciju i bojenje.

Citolološki uzorci mogu biti neobojeni i obojeni razmazi, otisci ili suspenzije stanica.           

Morfometrija je kvantitativni opis geometrijskih karakteristika struktura u svim dimenzijama.

Morfometrijski parametri mogu se podijeliti u četiri grupe: 1. jednostavni parametri (površina,  promjer, opseg,   najduža os i  najkraća os); 2. čimbenici oblika  (čimbenici pravilnosti i  konveksiteta);   3. dvofazni parametri (nukleocitoplazmatski odnos i ekscentričnost) te 4. kontekstualni parametri ( površina nakupina unutar stanice ili jezgre, broj elemenata po nakupini, oblik nakupine i udaljenost između nakupina).

Abnormalni sadržaj DNA, odnosno aneuploidija, je karakteristika maligniteta, te određivanje količine DNA ima važnu primjenu u onkologiji u poboljšanju sigurnosti u tumorskoj dijagnozi kao i u prognozi.

Ploidnost stanice indirektno govori o proliferacijskom statusu stanice.

Određivanje količine DNA može se vršiti i protočnim citometrom, ali je kompjuterska analiza na preparatima ima prednosti zbog  morfološke vizualizacije  ispitivanih stanica (malignih i referentnih).      

SIMPOZIJ NOVE TEHNIKE U KLINIČKOJ CITOLOGIJI

56.    LASER SCANNING CYTOMETRY: A NEW DIAGNOSTIC TOOL IN ROUTINE CYTOLOGY

R. Bollmann, J. Schmitz, C. Vogel, M. Bollmann

Laser-Scanning-Cytometry (LSC) is a newly developed technology to measure certain cytometric parameters like DNA-content and antigen expression or FISH. The method eliminates many of the drawbacks of flow-cytometry and image analysis.

We are using the instrument in routine diagnostic pathology for ploidy analysis of solid tumors and cytological preparations. With the instrument we are also able to quantify immunological parameters e.g. hormon receptors or MIB1. It even is possible to calculate which fraction of the tumor is more or less positive. Through multiparameter analysis immunotyping of lymphoma is also possible.

SIMPOZIJ NOVE TEHNIKE U KLINIČKOJ CITOLOGIJI

57.      Usporedba morfologije i DNK analize u punktatima prostate

Karmen Trutin Ostović, Zorana Miletić, Željka Znidarčić, Goran Bedalov, Renata Heinzl, Tajana Štoos-Veić, Gordana Kaić, Mladen Petrovečki

Aspiracijska citologija prostate ima vrlo važnu ulogu u postavljanju dijagnoze lezija prostate i praćenju liječenja pacijenata. Željeli smo ispitati da li analiza sadržaja DNK protočnom citometrijom, kao jedna od objektivnih metoda, može poboljšati citološku (morfološku) dijagnozu.

Od 1997. do 2000. godine analizirali smo protočnom citometrijom ploidiju i proliferaciju u 160 punktata prostate. Ispitivanje je obuhvatilo pacijente kod kojih je postavljena citološka dijagnoza žljezdane hiperplazije, atipične žljezdane hiperplazije i karcinoma. Aneuploidija je prisutna u 29 (15 %) pacijenata: u 2 (3,9 %) pacijenta od 51 s atipičnom žljezdanom hiperplazijom i u 26 (67,3 %) pacijenata od 38 s karcinomom. Povišena proliferativna aktivnost je pronađena u 79 (49,2 %) pacijenata: u 9 (20,5 %) sa žljezdanom hiperplazijom, u 37 (72,5 %) s atipičnom žljezdanom hiperplazijom i u 29 (76,5 %) s karcinomom. Aneuploidija korelira pozitivno s karcinomom, a visoka proliferacija s atipičnom žljezdanom hiperplazijom i karcinomom (Fisherov test vjerojatnosti p< 0,001).

Možemo zaključiti da je potrebno, uz morfološku analizu, napraviti i analizu sadržaja DNK budući da nam ploidija i proliferacija stanica omogućuju bolji protokol za praćenje pacijenata s atipičnom žljezdanom hiperplazijom i karcinomom.

SIMPOZIJ NOVE TEHNIKE U KLINIČKOJ CITOLOGIJI

58.     DNA- IMAGE CITOMETRIJA U SUBTIPIZACIJI VELIKOSTASTIČNIH LIMFOMA

Borovečki A, Kardum-Skelin I, Šušterčić D, Ostojić S, Vrhovac R. Radić-Krišto D, Jakšić B

Klinika za unutarnje bolesti KB "Merkur", Zagreb

Malignitet karakterizira promjena sadržaja DNA -  aneuploidija. Morfološke karakteristike jezgara malignih stanica vidljive u standardnim May- Grunwald-Giemsa bojenim preparatima, svojom hiperkromazijom upućuju na promjenu sadržaja DNA.

Budući su te promjene nedostupne vizualnoj kvantifikaciji u njihovoj analizi koristi se automatski analizator slike, koji se sastoji od mikroskopa, video kamere i računala s odgovarajućim programom za analizu slike SFORM, koji omogućuje numeričku objektivizaciju promjene intenziteta obojenja.

Analizirali smo 31 punktat limfnog čvora bolesnika oboljelih od velikostaničnih limfoma - 6 bolesnik s Burkitt i Burkitt-like limfomom,  4 bolesnika FC III, 10 bolesnika ALCL-om  ( T ili 0) te 11 bolesnika s  DLBCL-om.  Preparati su obojeni metodom po Feulgenu.

Rezultati su pokazali da postoji heterogenost u količini DNA unutar istovjetnih morfloških podskupina velikostaničnih limfoma. Postotak stanica >30 u  S+G2M fazi ili >30% stanica sa DNA> 4N govori za brzi relaps bolesti, kraće preživljenje ili pak korelaira s kompleksim kromosomskim abnormalnostima.

Precizno kvantificiranje količine DNA koristi se ne samo u dijagnozi, već i u klasifikaciji i prognozi različitih bolesti, prvenstveno malignih tumora.

SIMPOZIJ NOVE TEHNIKE U KLINIČKOJ CITOLOGIJI

59.     MORFOMETRIJSKI PARAMETRI LIMFATIČNIH STANICA U BOLESNIKA S KRONIČNIM LIMFOPROLIFERATIVNIM BOLESTIMA U ODNOSU NA NORMALNE LIMFOCITE

Borovečki A, Kardum-Skelin I, Šušterčić D, Vrhovac R, Radić-Krišto D, Jakšić B

Klinika za unutarnje bolesti KB "Merkur", Zagreb

Apsolutna limfocitoza u perifernoj krvi, infiltracija koštane srži, limfnih čvorova i/ili slezene malim limfocitima karakterizira kroničnu limfocitnu leukemiju (CLL).

Istraživanjem je obuhvaćeno 10 uzoraka periferne krvi i koštane srži kod normalnih osoba, 10 uzoraka periferne krvi  i koštane srži   bolesnika s CLL-om te 4 punktata limfnih čvorova kod istih bolesnika. Ukupno je analizirano 1000 limfocita periferne krvi kod normalnih osoba i bolesnika s CLL-om, 1000 limfocita koštane srži kod normalnih osoba i bolesnika s CLL-om te 400 limfocita punktata limfnih čvorova kod bolesnika s CLL-om. Morfometrijski su analizirani parametri cijele stanice te posebno jezgre: oblik, površina, konveksitet te faktori pravilnosti (faktor opsega, faktor konveksiteta te faktor izduženosti). Nije nađena statistički značajna razlika niti u jednom od navedenih parametara između normalnih limfocita i limfocita u bolesnika s CLL-om. Isto tako, nije uočena heterogenost limfocita u različitim odjeljcima tumorske mase (perifernoj krvi, koštanoj srži i limfnim čvorovima) najvjerojatnije zbog malog broja uzoraka, ali i zbog odabira tipičnih oblika CLL-a. Sama morfometrija limfocita nije dovoljna, kao posebni kriterij, za diferencijaciju normalnih od neoplastičnih limfocita u CLL-u te su, osim samog izgleda, potrebne i dodatne pretrage: apsolutna limfocitoza  (> 5x1099/L), infiltracija koštane srži, određivanje fenotipa te klonalnost limfocita.

SIMPOZIJ NOVE TEHNIKE U KLINIČKOJ CITOLOGIJI

60.   SEROZNI TUMORI OVARIJA - ANALIZA AgNOR a NA CITOLOŠKIM UZORCIMA

Štemberger-Papić S, Verša-Ostojić D, Stanković T, Vrdoljak-Mozetič D, Seili-Bekafigo I.

SAŽETAK: Cilj rada bio je odrediti broj i veličinu pojedinačnih AgNOR-a i AgNOR

nakupina, kao i omjer veličine ukupnog AgNOR-a u odnosu na jezgru, na citološkim uzorcima benignih, granično malignih i malignih seroznih tumora ovarija.

Analizirani su citološki uzorci 15 bolesnica, sa potvrđenom patohistološkom

dijagnozom (5 benignih, 5 granično malignih, 5 malignih seroznih tumora ovarija). Citološki otisci obojeni su metodom po Papanicolaou , zatim odbojeni, pa ponovo

obojeni impregnacijom srebrom za analizu AgNOR-a. Analizirano je 100 jezgara po uzorku, uz povećanje 1000 puta, pomoću programa za digitalnu obradu slike "SFORM".

Dobiveni rezultati ukazuju da postoji statistički značajna razlika u broju i površini pojedinačnih AgNOR-a i AgNOR nakupina između sve tri analizirane skupine. Statistički značajna razlika uočena je i u veličini ukupnog AgNOR-a, kao i u omjeru veličine ukupnog AgNOR-a u odnosu na jezgru.

Rezultati upućuju na mogućnost korištenja AgNOR-tehnike kao dodatne metode u diferencijalnoj citološkoj dijagnozi benignih, granično malignih i malignih seroznih tumora ovarija.

SIMPOZIJ NOVE TEHNIKE U KLINIČKOJ CITOLOGIJI

61.     ANALIZA AgNOR-a NA CITOLOŠKIM UZORCIMA BENIGNIH, GRANIČNIH I MALIGNIH MUCINOZNIH TUMORA OVARIJA

Verša-Ostojić D, Štemberger-Papić S, Stanković T, Seili-Bekafigo I, Vrdoljak-Mozetić D.

Sažetak

U radu je obrađeno 16 uzoraka otisaka mucinoznih tumora ovarija koji su na osnovu patohistološke potvrde svrstani u tri kategorije: benigni tumori (5), tumori graničnog maligniteta (5), maligni tumori (6).

Cilj rada bio je ispitati mogućnost diferencijalne dijagnoze benignih, tumora graničnog maligniteta i malignih mucinoznih tumora ovarija upotrebom srebrom obojenih regija nukleolarnih organizatora (AgNOR). Citološki uzorci obojeni po Papanicolaou metodi odbojeni su i obojeni impregnacijom srebrom, odabrano je sto stanica te je izvršena analiza pod povećanjem 1000 puta pomoću programa za digitalnu obradu slike "SFORM".

Dobiveni rezultati ukazuju da upotrebom analize varijance postoji statitistički značajna razlika između sve tri skupine u ukupnoj površini pojedinačnih AgNOR-a po jezgri.

Upotrebom POST-HOC LSD testa rezultati pokazuju mogućnost razlikovanja benignih tumora i tumora graničnog maligniteta mjerenjem ukupne površine, minimalnih i maksimalnih pojedinačnih AgNOR-a

U razlikovanju graničnih od malignih mucinoznih tumora nije nađena statistička značajnost niti u jednom parametru.

Rezultati ukazuju da AgNOR tehnika pokazuje ograničene mogućnosti u razlikovanju mucinoznih tumora ovarija.

POSTER

62.     VRIJEDNOST DNA – IMAGE CITOMETRIJE U DIJAGNOZI I PROGNOZI ALL ODRASLIH

Seili-Bekafigo I, Kardum-Skelin I, Šušterčić D, Jakšić B

KBC Rijeka - Interna klinika

Uz pomoću DNA-image citometrije analizirani su limfoblasti u koštannj srži odraslih pacijenata, sa akutnom limfatičnom leukemijom (ALL), u vrijeme postavljanja dijagnoze. Ispitana je povezanost DNA-parametara sa FAB subtipom ALL, te potencijalni prognostički značaj tih paramtnetara s obzirom na ukupno trajanje preživljavanja. Određivani su slijedeći parametri: DNA-indeks (Dl, udio stanica u S+G2M fazi staničnog ciklusa, te udio stanica sa sadržajem DNA>2n. U analazi su korišteni arhivski materijaii punktata koštane srži 49 odraslih pacijenata sa ALL, koji su prethodno bili obojeni po MGG-u. Preparati su prvo odbojeni, a zatim ponovo obojeni metodorn po Feulgenu, te analizirani uz pomoć kompjuterskog programa za analizu slike SFORM. Sadržaj DNA u limfoblastima koštane srži svakog bolesnika izražen je u obliku DNA histograma. Glavni vrh DNA-histograma blasta očitan je kao vrijednost ploidije većine populacije blasta.

Rezultati su pokazali da, iako je DI prosječno najveći u ALL-L3 FAB podskupini, ove prosječne vrijednosti nalaze se unutar diploidnih okvira, kao i u preostale 2 FAB podskupine ALL, te ne postoji značajna razlika u vrijednostima DI između tri FAB subtipa ALL. Ploidija izražena kao DI, nije pokazala ni značajniju povezanost sa prognozorn. U odnosu na FAB subtip najveći % stanica u S+G2M fazi nađen je kod ALL-L3 (37.854%), što je u skladu sa dostupnim literaturnim podacima. Lošiju prognozu predvida nalaz >30% stanica u S+G2M fazi  ciklusa, kao i >30%  stanica  sa DNA>4n.  Samo određivanje ploidije (DI) ne daje korisne prognostičke informacije kod  ALL.

Određivanje proliferacijske frakcije stanica izražene kao udio stanica u S+G2M fazi staničnog ciklusa, ili kao udio stanica sa sadržajem DNA>2n može pridonijeti svrstavanju pacijenata u prognostičke skupine.